NGS, selección del tamaño adecuado de fragmentos
10.07.19 – Javier Alvarez
Una de las partes críticas en un workflow NGS es la preparación de la biblioteca, que en casi todos los casos implica algún tipo de purificación selectiva de tamaño para eliminar los fragmentos no deseados que interferirán con los pasos de preparación, secuenciación y análisis de la biblioteca posterior.
Existen distintos procedimientos para eliminar enzimas y tampones no deseados, o nucleótidos y adaptadores empleados para preparar la biblioteca. En los métodos de selección de tamaño dual, los fragmentos de ADN más grandes y más pequeños se eliminan para garantizar el tamaño óptimo de la biblioteca antes de la secuencia final.
En todos los casos, la precisa selección de tamaño es clave para garantizar los resultados de la secuenciación NGS.
Los métodos y químicas actuales implican purificaciones seriadas que causan pérdidas del 20-30% de ADN en cada paso de purificación. En principio, solo sería necesario un mayor material de partida -en ocasiones limitado- o más ciclos de PCR que pueden causar sesgos en la secuenciación.
Son tres los factores principales responsables de la falta de reproducibilidad de los métodos de selección por tamaño actuales:
- Alta viscosidad. La química empleada se adhiere a las puntas causando errores de pipeteo y falta de reproducibilidad que se solventan con programaciones muy ajustadas de protocolos automatizados.
- Velocidad de la respuesta magnética. La resina química presenta una respuesta lenta al imán que requiere aumentar los tiempos de incubación para permitir una captura completa de ADN. En los métodos de selección de tamaño dual pueden generarse cortes de tamaño incorrectos y fragmentos más grandes de los deseados.
- Especificidad de tamaño. Las químicas actuales dificultan la eliminación total de los fragmentos grandes que pueden interferir con el clustering.
Emplea el nuevo sistema ProNex® y selecciona los fragmentos de 100 pb a 750 pb de dsDNA.
El sistema de purificación selectiva de tamaño ProNex®, basado en resina magnética, presenta menor viscosidad, y un tiempo de respuesta de imán aproximadamente cinco veces mayor que las perlas AMPure® XP, lo que permite una selección de tamaño más precisa y con mejores rendimientos.